HJ1001-2018水质三种大肠菌群测定酶底物法全文查看

　　为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定方法，我国生态环境部制定了本标准。下面凯发k8国际就和大家分享一下该标准的发布稿全文。

水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法

Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method

1 适用范围

本标准规定了测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。

本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定。

本方法的检出限为10MPN/L。

2 规范性引用文件

本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验用水规格和实验方法

GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导

HJ 494 水质 采样技术指导

HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1 总大肠菌群 total coliforms

37℃培养 24 h，能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。

3.2 粪大肠菌群 fecal coliforms

又称耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms)。44.5℃培养 24 h，能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。

3.3 大肠埃希氏菌 Escherichia coli

俗称大肠杆菌。37℃培养 24 h，能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚，同时产生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase)，分解选择性培养基中的 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2(MUG)释放出荧光物质(4-甲基伞形酮)的肠杆菌科细菌。

3.4 最大可能数 most probable number(MPN)

又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量(单位体积存在目标微生物的最大可能数)。

4 方法原理

在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生β-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解为黄色的邻硝基苯酚(ONP);大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶，将选择性培养基中的 4- 甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解为 4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下产生荧光。统计阳性反应出现数量，查 MPN 表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。

5 干扰和消除

5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集(8.1)时加入硫代硫酸钠溶液(6.4)消除干扰。

5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集(8.1)时加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.5)消除干扰。

6 试剂和材料

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水应满足 GB/T 6682中三级水的要求。

6.1 培养基。

本标准采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培养基。每100 ml样品需使用培养基粉末2.7 g±0.5 g，所含基本成分如下：

培养基成分

也可采用市售商品化培养基制品。

6.2 硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。

6.3 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)。

6.4 硫代硫酸钠溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10 g/ml。

称取 15.7 g 硫代硫酸钠(6.2)，溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。

6.5 乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml。

称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠(6.3)，溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液保质期为30d。

6.6 97 孔定量盘：含 49 个大孔，48 个小孔。其中，每个小孔可容纳 0.186 ml 样品，大孔中 48 个大孔每个可容纳 1.86 ml 样品，一个顶部大孔可容纳 11 ml 样品。也可采用经环氧乙烷灭菌的市售商品化成品。

6.7 标准阳性比色盘。

6.8 无菌水：取适量实验用水，经 121℃高压蒸汽灭菌 20 min，备用。

7 仪器和设备

7.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。

注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。

7.2 高压蒸汽灭菌器：121℃可调。

7.3 恒温培养箱：允许温度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。

7.4 程控定量封口机：用于 97 孔定量盘(6.6)的封口。

立科程控定量封口机

7.5 紫外灯：365～366 nm。

7.6 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用计量合格的可调式移液器。

7.7 三角瓶：100 ml。

7.8 量筒：100 ml±1 ml。

7.9 一般凯发在线客户端下载网址常用仪器和设备。

注：三角瓶、移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具要在试验前按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌 20 min，烘干，备用。

8 样品

8.1 样品采集

点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。

采集微生物样品时，采样瓶(7.1)不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。

采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面 10～15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。

从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 3～5 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%～75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。

采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。

在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。

如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液(6.4)，以除去活性氯对细菌的抑制作用(每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液);如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.5)，以消除干扰(每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液)。

注：15.7 mg 硫代硫酸钠(6.2)可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。

8.2 样品保存

采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10℃以下冷藏但不得超过 6 h。凯发在线客户端下载网址接样后，不能立即开展检测的，将样品于 4℃以下冷藏并在 2 h 内检测。

9 分析步骤

9.1 样品稀释

根据样品污染程度确定接种量(见表 1)，避免接种样品培养后 97 孔定量盘(6.6)出现全部阳性或全部阴性。接种量小于 100 ml 时，应稀释样品后接种，接种量为 10 ml 时，取 10 ml 样品加入到盛有 90 ml 无菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混匀制成 1:10 的稀释样品，其他接种量的稀释样品依次类推。对于未知样品，可选用多个接种量进行检测。

9.2 接种

量取 100 ml 样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶，加入 2.7 g±0.5 g 培养基(6.1)粉末，充分混匀，完全溶解后，全部倒入 97 孔定量盘(6.6)内，以手抚平 97 孔定量盘背面，赶除孔内气泡，然后用程控定量封口机(7.4)封口。观察 97 孔定量盘颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘(6.7)的颜色，则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后，终止试验或重新操作。

注：9.1、9.2 步骤在野外操作时应避开明显局部污染源，建议使用一次性手套、口罩、酒精灯等。

9.3 培养

测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，将封口后的 97 孔定量盘放入恒温培养箱(7.3)中37℃±1℃下培养 24 h。

测定粪大肠菌群时，将封口后的 97 孔定量盘放入的恒温培养箱中 44.5℃±0.5℃下培养24 h。

9.4 对照试验

9.4.1 空白对照

每次试验都要用无菌水(6.8)按照步骤 9.1～9.3 进行凯发在线客户端下载网址空白测定。培养后的97孔定量盘不得有任何颜色反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

9.4.2 阴性和阳性对照

总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表 2。

将标准菌株制成300～3000个/ml 的菌悬液，将菌悬液按接种(9.2)和培养(9.3)要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应;阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。

注：可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，然后根据实际情况用无菌水(6.8)稀释至 300～3000 个/ml。

9.4.3 结果判读与计数

将培养24h后的97孔定量盘进行结果判读，样品变黄色判断为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性;样品变黄色且在紫外灯(7.5)照射下有蓝色荧光，判断为大肠埃希氏菌阳性。如果结果可疑，可延长培养至28h进行结果判读，超过 28 h 后出现的颜色反应不作为阳性结果。可使用保质期内的标准阳性比色盘以辅助判读，参见附录 A。

分别记录97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。

10 结果计算与表示

10.1 结果计算

从97孔定量盘法MPN表中查得每100ml样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌的MPN值(置信区间参见附录C)后，再根据样品不同的稀释度，按照公式(1)换算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度(MPN/L)：

大肠菌群浓度计算公式

10.2 结果表示

测定结果保留两位有效数字，当测定结果≥100 MPN/L 时，以科学计数法表示;若 97孔均为阴性，可报告为总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌未检出或<10 MPN/L。

11 精密度和准确度

11.1 精密度

6 个凯发在线客户端下载网址分别对低浓度(地下水，浓度均值为 6.0×100MPN/L)、中浓度(地表水，浓度均值为 4.0×10000 MPN/L)和高浓度(生活污水，浓度均值为 9.0×10000000MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为 2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定：凯发在线客户端下载网址内相对标准偏差范围分别为 0.26%～1.3%、0.65%～2.0%、1.3%～3.7%和 0.68%～2.8%;凯发在线客户端下载网址间相对标准偏差分别为 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%;重复性限为 0.17、0.18、0.21 和 0.18;再现性限为 1.8、0.23、0.38 和 0.20;凯发在线客户端下载网址间置信区间见表 3。

6个凯发在线客户端下载网址分别对低浓度(地下水，浓度均值为70MPN/L)、中浓度(地表水，浓度均值为 9.0×1000MPN/L)和高浓度(生活污水，浓度均值为 2.0×1000000MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为 2000MPN/L)进行了 6 次重复测定：凯发在线客户端下载网址内相对标准偏差范围分别为 0.69%～1.9%、0.93%～2.9%、5.4%～21%和 1.8%～3.0%;凯发在线客户端下载网址间相对标准偏差分别为 9.6%、1.6%、15%和 3.7%;重复性限为 0.23、0.21、0.58 和 0.19;再现性限为 1.7、0.26、0.90 和 0.35;凯发在线客户端下载网址间置信区间见表 4。

6个凯发在线客户端下载网址分别对低浓度(地下水，浓度均值为 1.0×100MPN/L)、中浓度(地表水，浓度均值为 1.3×10000MPN/L)和高浓度(生活污水，浓度均值为 3.0×1000000MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为3700MPN/L)进行了 6 次重复测定：凯发在线客户端下载网址内相对标准偏差范围分别为 0.40%～2.4%、1.3%～2.9%、3.4%～17%和 2.4%～9.2%;凯发在线客户端下载网址间相对标准偏差分别为 8.9%、6.4%、6.6%、6.4%;重复性限为 0.22、0.26、0.58 和 0.55;再现性限为 1.6、0.76、0.64 和 0.75;凯发在线客户端下载网址间置信区间见表 5。

11.2 准确度

6家凯发在线客户端下载网址对总大肠菌群有证标准样品(2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定：凯发在线客户端下载网址内的相对误差范围为-6.4%～-3.5%;相对误差的最终值为-4.7%±1.2%。

6家凯发在线客户端下载网址对大肠埃希氏菌群标准样品(2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定：凯发在线客户端下载网址内的相对误差范围为-15%～-6.3%;相对误差的最终值为-13%±3.3%。

6家凯发在线客户端下载网址对粪大肠菌群的有证标准样品(3700 MPN/L)进行了 6 次重复测定：凯发在线客户端下载网址内的相对误差范围为-17%～-0.81%;相对误差的最终值为-13%±6.1%。

注：微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部经以 10 为底对数转换后进行计算。

12 质量保证和质量控制

12.1 每批样品按对照试验(9.4)进行空白对照测定，定期使用有证标准菌株进行阳性和阴性对照试验。

12.2 每 20 个样品或每批次样品(≤20 个/批)测定一个平行双样。

12.3 对每批次培养基须使用有证标准菌株进行培养基质量检验。

12.4 定期使用有证标准菌株/标准样品进行质量控制。

13 废物处理

实验中产生的废物经 121℃高压蒸汽灭菌 20 min 后，作为一般废物处理。

　　以上就是HJ1001-2018水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法发布稿标准的全部内容了，有需要的朋友可以参考。